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Material und Methoden

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durch Probe-PCRs auszutesten und anschließend mittels Agarose-

Gelelektrophorese zu kontrollieren.

Im 2. Schritt wird die DNA gewaschen. Dazu werden die MicroSpin-Säulen

abzentrifugiert und das in einem Eppendorf-Hütchen aufgefangene Zentrifugat

verworfen. Anschließend wird die DNA auf die Säule gegeben und erneut

zentrifugiert. Die gereinigte DNA wird bis zur weiteren Verwendung bei 4°C

gelagert.

Für die Cycle-Reaktion wird der Ansatz zusammenpipettiert, der sich für jeden

zu amplifizierenden Strang wie folgt zusammensetzt:

O

DEPC-H

O

gewaschene DNA

O

Forward (P 172)- bzw. Reverse (M 13)-Primer

Die für den Kettenabbruch notwendigen dd-Nukleotide (2

O SUR 1XNOHRWLG SUR

6WUDQJ ZHUGHQ YRUJHOHJW XQG MHZHLOV  O GHV $QVDW]HV EHLJHI

ügt. In jedem

Röhrchen sind somit die Nukleotide dATP, dCTP, dGTP und dTTP und

entsprechend dem gewählten Reagenz ddATP, ddCTP, ddGTP bzw. ddTTP.

Die Reaktionsgemische werden einer definierten Sequenz-Reaktion zugeführt,

bei der zu Anfang 3 Minuten bei 95°C denaturiert wird. In den sich

anschließenden 26 Zyklen wird zuerst für 30 Sekunden bei 95°C denaturiert

und anschließend für 30 Sekunden die Temperatur bei 65°C zum Annealing,

d.h. zum Anlagern der dd-Nukleotide gehalten. Am Ende der Cycle-Reaktion

werden die Proben auf 4°C heruntergekühlt und mit zum endgültigen Abbruch

GHU5HDNWLRQO)RUPDPLGORDGLQJG\HYHUVHW]W

Im dritten Schritt wird zunächst die Sequenzplatte mit Ethanol gereinigt und alle

Unreinheiten sorgfältig entfernt, da diese den Lauf erheblich behindern. Die

Kammer wird zusammengesetzt und das Gel hergestellt. Dazu werden in einem

Messbecher 48 ml Sequagel 6% und 12 ml Complete Buffer

zusammengebracht und auf einem Magnetrührer auf kleinster Stufe

GXUFKPLVFKW'HP*DQ]HQZHUGHQ  O$36EHLJHIügt. Nach 1 Minute wird

das noch flüssige Gel mit Hilfe einer Spritze zwischen die beiden Platten der

Kammer gegossen, wobei auf Luftblasenfreiheit zu achten ist. Das Gel wird für

2 Stunden zum Polymerisieren zur Seite gestellt.

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